Il giovane Peter Parker (Tobey Maguire) alias Spider-Man ha deciso di intraprendere la carriera di fotografo, in quel di New York alterna le sue incursioni da giustiziere mascherato con piccoli lavoretti come il Pizza-Express e i servizi fotografici free-lance per il Daily Bugle.
Il suo amico Harry (James Franco) figlio ed erede della colossale fortuna di Norman Osborn (Willem Dafoe), il Goblin del primo episodio, finanzia le ricerche del premio Nobel Dottor Octavius (Alfred Molina), esperimenti sulla fusione a freddo, mentre Mary Jane (Kirsten Dust) ha intrapreso una carriera d’attrice teatrale e vista l’indecisione di Peter, sta progettando di sposarsi con il pilota aero-spaziale John Jameson (Daniel Gillies), figlio del direttore del Daily Bugle J. Jonah Jameson (J. K. Simmons).